W środkowo-wschodniej części Rzeczypospolitej, kanclerz wielki koronny – Jan Zamoyski, w ostatniej ćwierci XVI w. podjął starania założenia nowego miasta. W przywileju króla Stefana Batorego z 12 VI 1580 r. jest m.in. mowa o tym, że jedyną wyznawaną religią będzie tu wiara katolicka i w związku z tym o zamierzonej fundacji i budowie kościoła. Od samego początku myślano o stworzeniu ośrodka duszpasterskiego.
20 VIII 1584 r. Jan Zamoyski wydał akt fundacji parafii zamojskiej tymczasowo przy kościele Świętego Krzyża z warunkiem przeniesienia jej do nowobudowanego kościoła kolegiackiego. Od 1587 r. rozpoczęły się prace przy budowie nowego kościoła
w Zamościu. Papież Klemens VIII na prośbę Ordynata Jana Zamoyskiego, 5 XII 1594 r. wydał bullę zatwierdzającą przywileje Kolegiaty wraz z ustanowieniem przy niej Kapituły Zamojskiej.
W 1600 r. pod przewodnictwem bp Stanisława Gomolińskiego przeniesiono parafię zamojską z kościoła Świętego Krzyża do kolegiaty. Uroczystość ogłoszenia aktu fundacyjnego i erygowania Parafii Kolegiackiej oraz ogłoszenia ostatecznego aktu fundacji Akademii Zamoyskiej odbyła się 5 VII 1600 r. Kolegiacie nadano wezwanie Zmartwychwstania Pańskiego i Jego świadka – św. Tomasza Apostoła.3 VI 1605 r. kolegiatę poświęcił 18 XI 1637 r. bp bakowski Jan Chrzciciel Zamoyski.
25 III 1992 r. kolegiata w Zamościu została podniesiona do godności Katedry nowopowstałej Diecezji Zamojsko-Lubaczowskiej.
Do końca XVIII w. parafia należała do diecezji chełmskiej, zaś na przełomie XVIII i XIX w. czasowo była wcielona do diecezji przemyskiej. W ciągu dziejów uległy zmianom granice parafii. W r. 1919 z terenu Parafii Kolegiackiej wydzielono Parafię Lipsko. Granice te znacznemu uszczupleniu uległy po II wojnie światowej: w 1949 r. powstała Parafia Świętego Krzyża w Zamościu, w r. 1979 Parafia św. Michała Archanioła w Zamościu, od r. 1982 Parafia św. Mikołaja w Zamościu (OO. Redemptorystów), którą w r. 1994 przejęli OO. Franciszkanie (obecnie parafia Zwiastowania NMP). W r. 1983 część ulic miasta przyłączono do utworzonej Parafii MB Królowej Polski w Zamościu, a wieś Płoskie do Parafii św. Jacka w Płoskiem. W 2005 r. wyodrębniono z Parafii Katedralnej osiedle Karolówka, tworząc Parafię Świętej Bożej Opatrzności.
Od samego początku był czczony w kolegiacie św. Tomasz Ap. i Matka Boża (od XIX w. w szczególny sposób w Obrazie MB Łaskawej lub Opieki, zwanej też Odwachowską). Specjalnym kultem cieszyły się relikwie świętych, umieszczone w kaplicy św. Magdaleny (Relikwii). Przy parafii była prowadzona szkoła, natomiast w XVII i XVIII w. Kapituła Zamojska prowadziła seminarium duchowne i Akademię Zamojską. Należy też wspomnieć o bibliotece kolegiackiej, która pod koniec XVIII wieku liczyła 1155 woluminów. Do dzisiaj zachował się po niej znaczny księgozbiór (aktualnie w Bibliotece Kurii Diecezjalnej).
Kościół katedralny jest trójnawową bazyliką, orientowany, złożony z pięcioprzęsłowego korpusu nawowego i wielobocznie zamkniętego prezbiterium opasanych rzędem niższych kaplic. Złożona i rozczłonkowana w rzucie bryła posiada elewacje ukształtowane przez schemat pilastrowo-arkadowy wielkiego porządku doryckiego. Wejście główne do Katedry tworzy dorycki łuk triumfalny z portalem na osi.
W latach 1824-1826, na rozkaz i pod osobistym nadzorem cara Aleksandra I oraz Wielkiego Księcia Konstantego, dokonano w kościele celowej, perfekcyjnie przygotowanej i przeprowadzonej przebudowy, połączonej z akcją niszczenia detali świadczących o chwale polskiego oręża i zasługach rodu Zamoyskich. Przekształcenia rosyjskie objęły bryłę kościoła, jego wnętrze i otoczenie z dzwonnicą. W wyniku tak programowo zaplanowanej przebudowy nastąpiła degradacja walorów architektonicznych zamojskiej Kolegiaty, zmieniając w sposób zasadniczy pierwotny wygląd i charakter tego kościoła. W czasie okupacji Niemcy dwukrotnie użytkowali Kolegiatę jako magazyn.
Próby remontu i naprawienia szkód z czasu zaboru miały swój początek już w połowie XIX w. W latach 1949-1951, pod nadzorem konserwatorskim prof. dra Jana Zachwatowicza i pod kierunkiem arch. Adama Klimka, rozpoczęto proces stopniowego przywracania historycznych form kościoła, wymowy symbolicznej i programowej. Przeprowadzono restaurację detali kamiennych we wnętrzu, na elewacjach odsłonięto spod wtórnych nawarstwień pierwotne elementy wystroju kamieniarskiego. Położono nowe tynki na fasadzie frontowej i we wnętrzu.
W latach 1989-1991, pod kierunkiem prof. Jerzego Kowalczyka i według projektu arch. Tadeusza Michalaka, przeprowadzono rekonstrukcję zachodniego szczytu. W następnych latach miały miejsce liczne prace remontowe i modernizacyjne, w tym remont krypt po stronie południowej.
W latach 2010-2012 zrealizowano „Remont konserwatorski i rekonstrukcję historycznej bryły Katedry w Zamościu wraz
z zagospodarowaniem terenu w jej otoczeniu”. Podstawowym celem prac była poprawa stanu technicznego oraz przywrócenie wyglądu Katedry w formie, jaką prezentowała w okresie przed XIX-wiecznymi przekształceniami.
Kościół katedralny ma bardzo bogatą symbolikę ideową i liturgiczną w duchu reformy potrydenckiej (eksponowanie kultu NMP, podkreślenie bóstwa Jezusa, przedstawienie Trójcy Świętej, starannie obmyślone wezwania kościoła i kaplic oraz szczegóły dekoracji) świadczącą o ważnej roli misyjnej tego kościoła. Z woli fundatora był on nie tylko wotum dziękczynnym – świątynią zwycięstwa, ale także hołdem wobec Matki Odkupiciela – Królowej Apostołów. We wnętrzu Katedry, na belkowaniu ponad arkadą łuku tęczowego, oddzielającego prezbiterium od nawy głównej umieszczono napis: DOMINA MEA VIRGO DEIGENITRIX IN COELUM ASSUMPTA EST – Pani Moja Bogurodzica Dziewica w niebo wzięta.
O szczególnym nabożeństwie ordynatów i wiernego ludu Zamościa do Matki Bożej świadczą kaplice, obrazy, bractwa, odpusty i składane wota. W Katedrze Maryi poświęcono kaplicę Bractwa Różańcowego, dawniej z obrazem Matki Bożej Zamojskiej (Hetmańskiej) a obecnie z kopią Obrazu Jasnogórskiego oraz obrazem MB Różańcowej ze św. Dominikiem. W kaplicy św. Mikołaja (Infułackiej) umieszczono obraz Wniebowzięcia NMP. Kaplica Bractwa Literackiego związana jest z wezwaniem Zwiastowania Najświętszej Maryi Panny, przedstawionym w obrazie florenckiego malarza Carlo Dolci. W kaplicy Przemienienia Pańskiego (Fundatorskiej) przez prawie dwieście lat znajdował się cudowny obraz MB Loretańskiej.
Po południowej stronie znajduje się kaplica św. Marii Magdaleny (kaplica św. Relikwii) oraz dawna kaplica Świętej Trójcy zamieniona w 1801 r. na kapitularz i bibliotekę Kapituły Zamojskiej. Po stronie północnej zaś, zaczynając od chóru, pierwsza z kaplic dedykowana jest św. Janowi Kantemu (Akademicka), następna Zwiastowaniu NMP (Bractwa Literackiego), kolejna – Panu Jezusowi Ukrzyżowanemu i ostatnia – Matce Bożej Opieki. Dawna kaplica Św. Krzyża, zlokalizowana na zamknięciu tej nawy przy prezbiterium, została w latach 1790-92 zamurowana i przeznaczona na zakrystię a nad nią umieszczono skarbiec Kolegiaty.
Kaplica pw. Przemienienia Pańskiego (Ordynacka, Zamoyskich), dawniej zwana Fundatorską i Pańską, usytuowana jest po południowej stronie prezbiterium Katedry, z otwarciem na przedłużeniu nawy bocznej. Kaplica stanowi mauzoleum grobowe Jana Zamoyskiego oraz monument sławy wielkiego Hetmana. Pod kaplicą znajduje się krypta z grobami ordynatów: dwóch pierwszych fundatorów i dwóch następców hetmana Jana Zamoyskiego.
W latach 1867-1871 ordynat Tomasz Stanisław Zamoyski przeprowadził gruntowną restaurację kaplicy rodowej, pod kierunkiem architekta Bolesława Pawła Podczaszyńskiego z Warszawy. Po śmierci XIV ordynata Tomasza Stanisława, syn jego ordynat Maurycy Zamoyski ustawił w kaplicy w 1891 r. nagrobek z białego karraryjskiego marmuru, dłuta Antonio Argentiego z Mediolanu.
Po stronie północnej Katedry znajduje się dzwonnica (53 m wys.) wzniesiona w latach 1755-75, w stylu późnobarokowym, autorstwa Jerzego de Kawe, Józefa Degena i Fryderyka Gisges. Dziś zwieńczona jest trójkątnymi klasycyzującymi szczytami i pseudobarkowym hełmem z krzyżem i kulą. We wnętrzu dzwonnicy zawieszone są 3 dzwony, stanowiące przykład polskiej sztuki ludwisarskiej: Jan (o wadze 4 300 kg, wysokości 160 cm, średnicy 200 cm), zaliczany do największych w Polsce, ufundowany w r. 1662 przez Jana Zamoyskiego Sobiepana, odlany przez lubelskiego ludwisarza Mikołaja de La Marche ze stopionego w pożarze zdobycznego dzwonu przywiezionego przez Jana Zamoyskiego z Rusi; Tomasz (1 200 kg, 105 cm wysokości, 140 cm średnicy), ofiarowany w 1721 r. przez Tomasza Józefa Zamoyskiego i Wawrzyniec (170 kg, 56 cm wysokości, 68 cm średnicy) ufundowany przez dziekana zamojskiego ks. Wawrzyńca Sikorskiego w 1715 r.). Ostatnie dwa dzwony odlał gdański ludwisarz Beniamin Witwerck.
W latach 2007-2013 przeprowadzono „Remont i adaptację Wieży Katedralnej dla zwiększenia atrakcyjności turystycznej Miasta Zamość jako kontynuację odnowy Zespołu Katedry w Zamościu”. Projekt objął prace remontowe i adaptacyjne, które polegały na poprawie stanu technicznego wieży pod kątem udostępnienia do zwiedzania turystom.
Obraz Matki Bożej Odwachowskiej
Od 19 II 1803 r. w kaplicy, po północnej stronie nawy znalazł schronienie szczególny Obraz Matki Najświętszej. Przeniesiono go
z odwachu (wartownia straży garnizonowej) przy ratuszu z obawy przed profanacją. Od połowy XVIII w. cieszył się on niezwykłym kultem wiernych. Mieszkańcy Zamościa czcili ten wizerunek jako słynący łaskami, nazywając Maryję Opiekunką lub Odwachowską. Według tradycji (potwierdzonej badaniami konserwatorskimi) Obraz namalował w 2 poł. XVIII w. na deskach drzwi osadzony na odwachu człowiek posądzony o popełnienie zbrodni. „Czując się czystym w obliczu Wszechstwórcy i własnego sumienia, a znalazłszy węgiel w wilgotnym i ciemnym miejscu nakreślił obraz Bogarodzicy na drzwiach swego więzienia, jako Opiekunki utrapionych. Błagał Ją o ulgę w cierpieniach i wykazanie jego niewinności. Po krótkiej, ale gorącej modlitwie łańcuchy go krępujące opadły, a obraz otoczyła nagła światłość…” Obraz wycięto z drzwi więzienia i zawieszono na ścianie odwachu (przypuszcza się, że zawieszano go także na murze otaczającym twierdzę zamojską).
Wiarę w skuteczność opieki Najświętszej Panny Maryi pogłębiały liczne łaski, jakich doznawali żarliwie modlący się przed Obrazem ludzie. Niezwykłe ożywienie kultu przypada na 1 poł. XIX w., od chwili przeniesienia Malowidła do Kolegiaty. Obraz był kilkakrotnie „poprawiany”, przemalowywany i upiększany, a w 1 ćwierci XIX w. został ozdobiony tkaniną zakrywającą całe tło, srebrnymi sukienkami i złoconymi koronami w otoczeniu wieńca dwunastu gwiazd. Zamojski Obraz można zaliczyć do typu przedstawień półpostaciowej Hodegetrii. Kompozycja postaci Maryi i Dzieciątka, układ dłoni, atrybuty wskazują na wzorzec ikony Matki Boskiej Smoleńskiej (obecnie w kościele dominikanów w Gdańsku). Liczne kopie i rozpowszechnienie wiary w skuteczność opieki NMP w tym wizerunku, zwłaszcza po poł. XVIII w., były prawdopodobnie źródłem, z jakiego czerpał natchnienie anonimowy autor obrazu zamojskiego. Łaskami słynący Wizerunek 9 IX 2000 r. został uroczyście ozdobiony przez Księdza Kardynała Józefa Glempa, Prymasa Polski, koronami papieskimi, które zostały 12 VI 1999 r. pobłogosławione przez Ojca Świętego Jana Pawła II w czasie wizyty w Zamościu 12 VI 1999 r.